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立論依據(jù)
(包括研究意義、國內外研究現(xiàn)狀分析，并附主要參考文獻及出處)
對基礎研究，著重結合國際科學發(fā)展趨勢，論述本課題的科學意義;
對應用基礎研究，著重結合學科前沿、圍繞國民經濟和社會發(fā)展中的重要科技問題，論述其應用情景。
研究意義：
新生兒壞死性小腸結腸炎(NEC)是新生兒時期嚴重威脅生命的消化系統(tǒng)急癥，以早產兒、小于胎齡兒發(fā)病者較多，在NICU患兒中的發(fā)病率高達10%，是早產兒死亡的重要原因之一。
臨床以腹脹、腹瀉、黏液血便和膽汁樣嘔吐為主要表現(xiàn)，腹部X線平片以腸壁囊樣積氣為特征，腸道病變范圍可局限或廣泛，回腸累及最多，黏膜呈凝固性壞死，粘膜下層彌漫性出血或壞死，嚴重者腸壁全層壞死甚至穿孔。
目前有很多方法用于診斷NEC。
除了可以根據(jù)臨床表現(xiàn)診斷外，腹部X線片是最常用的輔助檢查方法，雖然其用于診斷NEC的特異度較高，但對于早期診斷NEC幫助不大，
目前也有很多關于IL-8、IL-10、IL-1受體拮抗劑等生化指標用于診斷NEC的研究，但缺乏較好的用于早期診斷NEC的血生化指標。
TLR是由Nomuria等在哺乳動物體內發(fā)現(xiàn)與果蠅Toll蛋白相似的一種蛋白。
TLR在不同細胞的表達和識別不同細胞因子在多種疾病的發(fā)病機制中起重要作用，目前研究發(fā)現(xiàn)TLR參與腫瘤、腸道免疫性疾病等多種疾病的發(fā)病。
在人類體內發(fā)現(xiàn)的TLR家族共有10個成員，其中TLR4是近年來研究較多的其中一個，TLR4主要表達在內皮細胞、巨噬細胞、中性粒細胞及DC上。
I-FABP是由小腸單層柱狀上皮細胞分泌的一種小分子蛋白質，占成熟的細胞基質蛋白的2%。
本研究旨在通過檢測NEC患兒血清中的TLR4及腸型脂肪酸結合蛋白，監(jiān)測其在NEC中的動態(tài)變化，作為NEC嚴重程度的生化指標，可為輔助診斷NEC提供依據(jù)，達到早期干預的目的。
國內外研究現(xiàn)狀分析：
TLR4上調導致NEC發(fā)生的機制研究
與LPS結合后，被激活的TLR4可以通過髓樣分化因子88(MyD88)依賴性和非依賴性兩個途徑介導炎癥因子的釋放。
其中MyD88依賴性途徑主要介導NF-kB活化和細胞因子產生，而MyD88的非依賴性途徑主要誘導LPS的干擾素(IFN)，以及干擾素誘導蛋白10(IP10)基因、糖皮質激素衰減反應基因16(GARG-16)、
干擾素調節(jié)基因1(IRG-1)的表達和DC的成熟，激活下游NF-kB、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)p38信號通路，誘導促炎癥因子如白細胞介素-1(IL-1)6、12和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等的表達。
Chan等研究發(fā)現(xiàn)，TLR4激活后能影響腸道粘膜的修復能力，此與其減少腸道細胞增殖、降低內皮細胞基底部粘附力及減少內皮細胞移動到受損位置的數(shù)量。
究證明，TLR4通過抑制細胞的增殖分化作用于wnt-β-5信號系統(tǒng)，使腸道粘膜修復能力受損，加重NEC的病理變化。
最新研究表明，TLR4不僅可以與LPS結合誘導炎癥反應、損傷腸道粘膜導致NEC發(fā)生，許多分子蛋白如纖維結合蛋白、透明質酸。
硫酸肝素等均能激活TLR4，在無外來病原菌時TLR4表達可能增高，釋放大量炎癥因子從而發(fā)生NEC的炎癥瀑布鏈式反應。
這一發(fā)現(xiàn)，可以解釋一些無明顯感染因素引起的NEC。
細菌及其產物如何引起腸上皮細胞的損傷探討
血小板活化因子(PAF)在NEC的發(fā)生中起重要作用。
有研究應用缺氧、低溫、人工喂養(yǎng)、細菌感染等方法制成了NEC的動物模型，結果發(fā)現(xiàn)腸上皮的PAF及其受體的表達增高，阻斷PAF的受體表達后NEC的發(fā)生率明顯下降。
PAF表達增高可使腸壁血管通透性增高、白細胞游出、細胞粘附分子的合成增多及活性氧生成增加，從而損傷腸壁。
有研究表明，PAF可活化腸上皮細胞的STAT，使磷酯酶A2及內皮素一1的合成增加，并可通過上bax的表達而誘導腸上皮細胞凋亡，從而損傷腸上皮細胞、破壞細胞問的連接而引起細菌移位
關于醫(yī)學開題報告范文精選精選3篇工作報告。
另外，PAF還可誘導腸上皮細胞產生TLR4，后者可活化IKK，從而激活NFxB而引起炎癥級聯(lián)反應。
如果敲除TLR4，則NEC的發(fā)生率明顯降低，說明TLR4在NEC的發(fā)生中也有重要作用。
沈滌華等研究表明I FABP可以作為早期腸缺血較理想的生物學指標，國外學者研究發(fā)現(xiàn)NEC患兒血清I-FABP水平明顯升高，且與NCE嚴重程度有關。
Thuijls等研究發(fā)現(xiàn)重癥NEC患兒在早期血I-FABP水平即明顯升高。
當臨床出
現(xiàn)輕度腹脹，大便隱血陽性懷疑NEC時，血、尿I FABP水平在發(fā)展成為重癥NEC的患兒
會明顯高于診斷為其他疾病和病情穩(wěn)定在NECI期或Ⅱ期的患兒。
主要參考文獻
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鄒靜靜，陳運彬.TOLL樣受體在新生兒壞死性小腸結腸炎中的表達及作用.中國新生兒科雜志 20__,27(5).
杰，劉靖華，姜勇.ToLL樣受體的發(fā)現(xiàn)及其研究進展.中國危重病急救醫(yī)學，,15:694-697
（一）選題背景
隨著科學技術的日新月異和生活水平的迅速提高，人們對于身體健康保障的要求越來越高。當病人突出心臟病、腦溢血、低血糖、癲癇病等突發(fā)性疾病時，病人的生命安危將在很大程度上決定于病人能否在最短時間內得到有效的救助。由此自然促進了急救業(yè)務的發(fā)展和常用急救知識的普及。但是在國內，整個急救體系還處于起步階段，存在的很多隱患可能在病人突發(fā)癥病后影響急救效率。例如，如果一個心臟病人在路邊散步時突然發(fā)病倒在路過該怎么辦？打電話？如果附近沒有公共電話呢？找人幫忙？一旦被非專業(yè)人員錯誤處理，導致延誤治療很可能弄巧成拙。打車送醫(yī)院？資料表明，當病人心跳停止后 5－10min腦細胞就開始死亡。換句話說：在這種情況下必須要讓專業(yè)急敵人員盡快到場才能保證病人的生命安全。從這個角度進行思考，我提出了這么一個設想：能不能設計一種裝置使得病人因突然發(fā)病而跌倒到醫(yī)生趕到救治的過程得到盡快的簡化呢？
我在專利局查閱有關資料之后，發(fā)現(xiàn)國內目前尚沒有此類產品的設計。一個類似創(chuàng)意的設計是：在一個瓶子內設置兩個金屬接點，瓶子內部灌一些水銀。當人站立時，水銀集中在一個接點處，電路斷開。當人倒地時，瓶子的傾斜使水銀同時接觸到2個接點，電路被觸發(fā)，瓶子內置的警報器發(fā)出警報，示意求助。這個設計顯然是很粗糙的。
（1）它只是通過身體傾斜的角度來決定是否報警，而不是按照真正的生理狀況，必然會出現(xiàn)很高的誤報率。
（2）它無非是在最短時間內引起了別人注意，卻并沒有使整個過程簡化，所以對于提高救護效率不會起到實質影響。
結合我自己的設想和現(xiàn)有設施的缺陷，我希望做出一套“倒地后急救體系”：當病人倒地之后，用一個監(jiān)測裝置感知病人諸如血壓、脈搏等生理狀況并進行數(shù)值分析。一旦確定病人已經發(fā)病，就發(fā)出無線電信號給最近的急救站，急救站通過GPS定位病人的位置并以最快的速度調度急救人員。
但是，經過兩個多月的探討，幾乎沒有任何進展，我?guī)缀醯搅艘艞壍牡夭健５?，在老師不斷的鼓勵和啟發(fā)下，有一天，靈感幸運地光顧了我的大腦——聲光求助，有線、無線電話報警都是成熟的技術，關鍵在于沒有一個能判斷病人因其他原因跌倒與突然發(fā)病而跌倒的智能開關裝置。
一旦這個設計能夠實現(xiàn)，將會具有重大的實際價值和社會價值。首先它使病人在急救最關鍵的一個環(huán)節(jié)上得到了最大的保障，很大程度降低了突發(fā)性疾病的危險性；其次，它會使急救行業(yè)出現(xiàn)新的概念、新的運營模式，也會促進相關產品（如GPS）的普及和推廣；另外，它可以使眾多患有突發(fā)性疾病的中老年人以輕松、樂觀的情緒面對生活，參與更多的社會活動，由此產生的社會效應將非?？捎^。
（二）研究方案
1．縱觀整個設計思路，大致可分為三大部分
第一階段：到醫(yī)院進一步收集有關病人（尤其是老年人）發(fā)病摔倒時候的具體生理反應的資料，比如倒地姿勢，血壓、脈搏的變化狀況等。這一階段的關鍵任務就是要通過資料分析抓住普通狀況下摔倒和因病倒地的不同。而資料估計將以心電圖和血壓數(shù)值的收集為重點。
第二階段：選擇適當?shù)姆绞浇邮账璧纳硇盘枴＿@一階段的關鍵在于選擇適當?shù)膫鞲衅饕越邮障鄬ξ⑷醯纳硇盘?。估計這一階段要考慮的問題是選擇什么性能的傳感器和如何分布傳感器，以達到最理想的試驗效果。
第三階段：設計分析電路。這一階段的任務就是要通過邏輯電路對傳感器接收的電信號進行分析以判斷使用者身體狀況是否正常。主要難點就在于如何找到一個適當?shù)臄?shù)學模型匹配實驗數(shù)據(jù)和如何把模型通過電路實現(xiàn)。目前主要有兩大實施方案：一是通過邏輯電路進行信號運算、識別；二是使用單片機編程識別。第一種方案的好處是處理問題直接，但當需要處理的信號相當復雜時，依靠單片機編程就顯得比較合適。選取哪種方案還要視具體情況而定。
第四階段：把以上各階段結果整合到一起，完成成品。
百合知母湯抗抑郁細胞內信號轉導通路的機制研究
研究生姓名：__
導師姓名、職稱：__ 教授
學科專業(yè)：基礎醫(yī)學院
研究方向：方劑的配伍規(guī)律及臨床運用
一 研究目的與意義
1.研究目的
百合病最早見于張仲景的《金匱要略》，屬中醫(yī)情志病范疇?！督饏T﹒百合狐惑陰屬陽毒病證治》篇將“百合病”描述為：“意欲食復不能食，常默然，欲臥不能臥，欲行不行，飲食或有美時，或有不用聞食臭時，如寒無寒，如熱無熱，口苦，小便赤，諸藥不能治，得藥則劇吐利，如有神靈者，身形如和，其脈微數(shù)。”從百合病的臨床表現(xiàn)看，與抑郁癥的診斷標準有較多的相似之處。所以現(xiàn)代不少醫(yī)家都將中醫(yī)的百合病歸屬于抑郁癥[1,2,3]。百合知母湯為治療百合病的經典方藥之一，由百合和知母兩味藥組成。百合寧心安神，潤肺止咳;知母清熱瀉火，滋陰潤燥。百合甘寒清潤而不膩，知母苦寒降火而不燥。百合偏于補，知母偏于瀉。二藥伍用，一潤一清，一補一瀉，共奏潤肺清熱，寧心安神之效。主治陰虛或溫熱病后余熱末清，以致頭昏、心煩不安、失眠等癥以及情志不遂，以致精神恍惚、不能自制等癥。 故本課題旨在通過體動物實驗揭示百合知母湯抗抑郁可能的細胞內信號轉導機制。
2.研究意義
抑郁癥是常見的危害人類身心健康一類精神疾病，以顯著而持久的情感或心境低落為主要特征，在WHO的一項流行病學調査中發(fā)現(xiàn)全世界約有10%-20%的人一生中曾有過抑郁體驗[4]。隨著現(xiàn)代社會的生活壓力逐漸增高、工作節(jié)奏加快，人們處于應激狀態(tài)中的機會增多，抑郁癥的發(fā)病率更逐年上升[5,6]，越來越多的患者正遭受抑郁癥的折磨，給家庭及社會造成了嚴重的經濟負擔。因此，加強抑郁癥的防治，尋找安全、有效的治療方法，具有非常重要的社會和經濟意義。
抑郁癥發(fā)病機制復雜，誘因繁多，針對某一單一環(huán)節(jié)的藥物難以取得滿意的療效，許多抗抑郁西藥存在抗抑郁譜窄、起效慢、藥價高、依從性差、副作用大及易復發(fā)等不足[7]。傳統(tǒng)的中醫(yī)學中蘊含著豐富的心身醫(yī)學思想，其“形神合一論”，“天人合一論”就包含了廣義的心身醫(yī)學思想。因此國內外越來越重視傳統(tǒng)中草藥及復方抗抑郁的研究，開展了廣泛而深入的實驗研究，積累了豐富的經驗，且實驗研究成果在臨床運用中也取得了良好的療效，為中醫(yī)學和現(xiàn)代心身醫(yī)學的融合、發(fā)展提供了新的契機。中醫(yī)心身醫(yī)學研究工作逐漸起步，心身醫(yī)學的中醫(yī)藥防治研究工作在病因病機及臨床診斷方面也取得一定的進展[8]。
隨著分子生物學的發(fā)展，抗抑郁藥物抗抑郁作用機制已由細胞外單胺遞質途徑，逐步轉向細胞內信號轉導機制，而目前針對百合知母湯抗抑郁作用機制的研究大都局限在行為學觀測、腦內神經遞質和神經內分泌等方面。本研究采用大鼠慢性應激結合孤養(yǎng)抑郁模型，對百合知母湯的抗抑郁作用及其細胞內作用機制進行研究，以期為其進一步的新藥開發(fā)研究和臨床應用提供實驗基礎。
二 研究現(xiàn)狀
1.百合病的研究現(xiàn)狀
1.1百合病的起源
百合病始見于張仲景《金匱要略·百合狐惑陰陽毒病證治第三》篇：百合病者，百脈一宗，悉致其病也。意欲食復不能食，常默然，欲臥不能臥，欲行不能行，飲食或有美時，或有不用聞食臭時，如寒無寒，如熱無熱，口苦，小便赤，諸藥不能治，得藥則劇吐利，如有神靈者，身形如和，其脈微數(shù)。這段文字概括了百合病的主要癥狀是精神、飲食、睡眠、行為、語言、感覺的失調，與西醫(yī)學抑郁癥的主要癥狀有頗多相似之處。“百脈一宗者，分之則為百脈，合之則為一宗”因人體百脈同出一源，源病則百脈合病，周身受累，因此而得名百合病。
1.2百合病的病因病機 百合病的病因病機為傷寒熱病之后，余熱傷陰，或情志不遂，郁熱傷陰，導致心肺陰虛內熱，百脈失養(yǎng)而成。病機特點是心肺陰虛內熱，心神失養(yǎng)，以神志改變?yōu)橹饕R床特點。心肺陰虛，余邪未盡，則出現(xiàn)口苦、小便赤、脈微數(shù)。該組癥狀是百合病的主要客觀體征。百脈遍布周身，百脈失和，則行動感覺變異，如“欲臥不能臥，欲行不能行”“意欲食復不能食，飲食或有美時，或有不用聞食嗅時”“如寒無寒，如熱無熱”等。神志失和，則現(xiàn)“如有神靈者”“常默默”。
1.3百合病的治療法則
百合病以心肺陰虛為基本病機，以滋養(yǎng)心肺、潤燥安神為治療法則?？伞半S證治之”分為以下幾型：①正治法：“百合病，不經吐、下、發(fā)汗，病形如初者，百合地黃湯主之?！卑俸喜∥唇浾`治，日雖久而病形如初者，以滋養(yǎng)心肺陰血，清熱安神為法，以百合地黃湯主之。取百合潤養(yǎng)心肺，清氣分虛熱，生地滋養(yǎng)心血，清血分虛熱，泉水煎藥，取清熱助陰，血熱從小便下行之功。諸藥合用，心肺得養(yǎng)，氣血同治，陰復熱清，百脈和調，病癥自除。②誤汗后：“百合病發(fā)汗后者，百合知母湯主之?！?百合病誤用汗法，汗后陰液受傷，心肺陰虛加重，燥熱尤甚，除具備百合病的基本癥狀外，尚可出現(xiàn)津傷燥熱的心煩、少寐、口干或渴、午后潮熱、小便短少等癥候。治宜養(yǎng)陰清熱、潤澡除煩，用百合知母湯主治。③誤下后的滑石代赭湯(百合、滑石、代赭石)。④誤吐后的百合雞子湯(百合、雞子黃)。⑤久病變渴的外用百合洗方(百合)。如內服外洗仍口渴不解，方用栝蔞牡蠣散(栝蔞根、牡蠣)。⑥久病變發(fā)熱的百合滑石散(百合、滑石)。
2.抑郁癥的研究現(xiàn)狀
2.1抑郁癥的起源
抑郁癥是一種情感性精神障礙，臨床上以情緒低落、思維遲緩和精神運動性抑制為特征，其它癥狀包括喪失自尊、不恰當?shù)膬染胃小⑺劳龊妥詺⒛铑^、注意力集中程度降低以及睡眠和食欲減退，還可能伴有各種軀體癥狀。
抑郁癥是一種最普通的精神疾病。我國對情感性精神障礙進行流行病學調查1985年：終生患病率約為12%。我國對抑郁癥的識別率低,臨床漏診率達50-60%。一般內科醫(yī)生對包括抑郁癥在內的心理障礙的識別率只有15.9%,約只有1/4的抑郁癥病人才能接受正規(guī)治療。有專家認為我國抑郁癥的發(fā)病率應為10-15%，隨著人口的逐步老齡化，抑郁癥在60歲以上人群中的發(fā)病率將高達 20%～50%。1994年WHO全球調查發(fā)現(xiàn),抑郁癥的現(xiàn)癥患病率現(xiàn)癥患病率為11.4%,終生患病率為20-30%。約13 - 20%的人一生中曾有過至少一次抑郁體驗。《20__ 年世界衛(wèi)生報告》指出，抑郁癥目前已成為世界第四大疾患，到 20__ 年抑郁癥可能成為僅次于心臟病的第二大疾病，抑郁癥正在成為一個嚴重的全球問題[9-13]。
2.2抑郁癥的發(fā)病
抑郁癥的病因十分復雜，一般認為病因可能與遺傳、人格特征、心因因素有關。其發(fā)病機制也處于假說階段，主要包括單胺遞質學說、神經內分泌學說、信號通路學說[14-15]。
單胺假說作為抑郁癥研究的重點認為單胺類神經遞質(如5-輕色胺、多巴胺、去甲腎上腺素等)的失衡可導致抑郁的發(fā)生。大量研究亦顯示抑郁癥與遺傳、神經、心理等因素誘發(fā)的中樞5-羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺(Norepinephrine,NE)、多巴胺(Dopamine, DA)等單胺類神經遞質含量降低及其受體功能下降有關 [16-17]。有研究[18]表明抑郁模型大鼠下丘腦、紋狀體、海馬內 5-HT、NE及DA 及其代謝產物、合成前體的含量明顯降低。這也支持了經典的單胺遞質學說。①5-HT：抑郁癥的發(fā)病機制涉及突觸間隙5-HT水平及5-HT受體亞型功能的失調。5-HT功能活動降低,則患者心情抑郁、食欲減退、運動活動減少。Coppent[19]等于1965年首先提出5-HT與抑郁癥有關,認為抑郁癥是由中樞神經系統(tǒng)5-HT釋放減少,突觸間隙的含量下降而引起的。近年來,研究發(fā)現(xiàn)了很多5-經色胺的受體亞型,使得5-HT遞質系統(tǒng)與抑都癥發(fā)病的關系越來越受到關注。②NE：大量研究證明腦內N E的絕對或相對缺乏會引起情緒低落、心境抑郁。Schildkraut[20]于1965年首先提出抑郁癥的發(fā)生是由于腦中NE不足所致,中樞神經系統(tǒng)中NE含量不足則發(fā)生抑郁癥NE的缺乏可能是由于內源性的生成釋放異常或由于NE系統(tǒng)慢性刺激所致的繼發(fā)性粍竭[21]。Bmnello[22]等指出,自從發(fā)現(xiàn)一些藥物通過改變NE代謝既能導致抑郁癥又能緩解抑郁癥,NE在抑郁癥中所起的作用越來越受到關注。③DA：1975年Randrup首先提出,抑郁癥的發(fā)病可能與DA有關。后來Maj等研究者證實,幾乎所有長期抗抑郁治療的患者都會增加D A誘導的獎賞反應。1983年Willner等提出抑郁癥存在DA功能的降低,尤其是伴隨有精神運動遲滯的患者[23]。對抑郁癥自殺者尸檢結果提示,抑郁癥自殺患者尾狀核和伏核的DA代謝率降低[24]。
目前,抑郁癥的神經內分泌機制研究中,下丘腦一垂體一腎上腺軸(HPA軸)功能亢進是較為公認的發(fā)病機制之一。大量研究顯示,抑郁癥患者的HPA軸功能 亢進,血漿促腎上腺皮質激素釋放激素CHR、促腎上腺皮質激素(ACTH)和皮質 醇(CORT)濃度明顯升高,而且這種功能亢進是依賴性的,隨著抑郁的恢復,HPA軸的功能也逐步恢復正常[25]。Catalan[26]等發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者下丘腦及下丘腦外的促腎上腺皮質激素釋放因子(CRF)濃度都升高,重度抑郁組比輕度與中度抑郁發(fā)作CRF血濃度更高,且CRF與皮質醇血濃度顯著相關。 在發(fā)病機制方面，受體后信號通路及其第二信使系統(tǒng)在該病發(fā)病及治療中的作用是當前研究的熱點。以腦內cAMP反應元件結合蛋白(cAMP response element binding protein ,CREB )為交匯點的細胞內信號轉導通路正受到越來越多的關注，尤其是海馬CREB的改變。早在1996 年，Nibuya[27]等就報道抗抑郁治療，大鼠海馬 CA1 區(qū)、CA3 區(qū)和齒狀回均可見CREB mRNA的表達增多。CREB 可能是各種抗抑郁信號轉導通路的交匯點。海馬CREB的表達和活化受到多種信號分子和信號通路的影響：
①腺苷酸環(huán)化酶/環(huán)磷酸腺苷/蛋白激酶A通路(AC/cAMP/PKA通路)，是研究最早的抗抑郁通路。其主要過程是：胞外信號激活胞膜上G蛋白耦聯(lián)受體→AC激活→胞內cAMP升高(降解cAMP的酶主要是磷酸二酯酶)→PKA激活→CREB磷酸化→調節(jié)基因轉錄→生物學效應。Li和Branski[28,29]等實驗研究發(fā)現(xiàn)海馬cAMP通路的激活對改善抑郁癥狀起積極作用。
②酪氨酸激酶受體B/絲裂原活化蛋白激酶/核糖體 S6激酶通路(TrKB/MAPK/RSK通路)，是一條和細胞生長、增殖、凋亡以及突觸可塑性密切相關的信號通路。在各種 MAPK 通路中，細胞外信號調節(jié)激酶1/2 (ERK1/2)信號通路與抑郁癥關系最為密切。ERK1/2 通路激活的大致過程是：TrKB 的激活→MAPK激酶激酶(MAPKKK, RAF)的激活→MAPK激酶(MAPKK, MEK)的激活→ERK1/2的激活→RSK的激活→ CREB 磷酸化→調節(jié)基因轉錄→生物學效應。抑郁癥患者的尸檢報告顯示腦內MAPK減少可能是嚴重抑郁癥的病因之一[30]。
③Ca2+/鈣調蛋白/鈣調蛋白依賴的蛋白激酶通路(Ca2+/CaM/CaMK通路)，通路涉及多種離子通道、受體和酶，其激活的主要過程是：胞漿內鈣濃度升高→鈣離子與CaM結合→激活CaMK→CREB磷酸化→調節(jié)基因轉錄→生物效應。王慶松等 [31]利用貓對大鼠造成急性捕食應激，發(fā)現(xiàn)在捕食應激后大鼠海馬細胞內 CaM 信 號通路調控紊亂，表現(xiàn)在細胞內 Ca2+濃度明顯升高，Ca2+-CaM 復合體增多，CaMK的表達升高，提示海馬該信號轉導通路在嚴重心理應激所致的行為異常中可能有重要意義。
3.百合知母湯的研究現(xiàn)狀
3.1百合的研究現(xiàn)狀
方中百合為百合科植物百合Lilium brownii F. E. Brown var. colchesteri Wils.、卷丹 Lilium lancifolium Thunb.和細葉百合 Lilium pumilum DC.的肉質鱗莖。味甘，性微寒。入心、肺經。本品氣味稍緩，甘中有收，既能清心肺之余熱，而斂氣養(yǎng)心、安神定魄，用于治療熱性病后、余熱末盡所引起的神思恍惚、煩躁失眠、莫名所苦的“百合病”，又能潤肺止咳，用于治療肺燥咳嗽，或肺虛久咳，或陰虛久咳、痰中帶血等癥。 百合中主要含有酚酸甘油酯、苷類、生物堿及多糖，另外還含有一些磷脂、蛋白質和無機元素。藥理研究表明百合具有抗癌、止咳、耐缺氧與抗疲勞、提高機體細胞免疫功能等作用[32-34]。
3.2知母的研究現(xiàn)狀
方中知母為百合科植物知母 Anemarrhena asphodeloides Bge.的根莖。味苦、甘，性寒。入肺、胃、腎經。本品質潤，苦寒不燥、，沉中有浮，降中有升。上行能清肅肺氣，以瀉肺火，潤肺燥、除煩熱、止咳嗽，用于治療溫熱病，邪在氣分，癥見高熱、煩躁、口渴、脈洪大者，以及陰虛燥咳，或肺熱咳嗽諸癥;入于中，善清胃火、除煩渴，用于治療消渴病之中消諸癥;行于下，則能瀉相火、滋腎燥，用于治療陰虛火旺、骨蒸潮熱、盜汗等癥。
知母主要含有皂苷、黃酮、雙苯吡酮、木脂素等成分。現(xiàn)代研究表明，知母具有抗病原微生物、抗血小板聚集、降血糖、解熱、抗炎、降低轉氨酶等多種藥理活性[35-37]。
3.3 百合知母湯的研究現(xiàn)狀
百合知母湯有養(yǎng)陰清熱、除煩潤燥之效，以潤養(yǎng)心肺為大法，治療百合病誤汗后，津液受傷，虛熱較甚者。臨床上運用百合知母湯治療乳腺增生病[38-39]、長期低熱[40]、消渴、喘證、盜汗、胃脘痛[41]、失眠[42]、抑郁[43]等癥。
三 研究思路與立題依據(jù)
1.研究思路 百合知母湯是《金匱要略》中治療百合病的經典方劑。百合病的描述“百合病者，百脈一宗，悉致其病也，欲臥不能臥，欲行不能行……意欲食復不能食，常默默，如有神靈者……”主要歸納為情緒障礙、軀體不適，與現(xiàn)代醫(yī)學抑郁癥的診斷標準有很大的相似性，因此一般將百合病歸屬于抑郁癥范疇。百合知母湯中的部分有效成分能通過提高抑郁癥大鼠大腦皮層單胺遞質、抑制HPA軸亢進、提高模型動物腦組織BDNF含量等途徑發(fā)揮抗抑郁效應。
CREB 可能是各種抗抑郁信號轉導通路的交匯點?？挂钟羲幬?包括中藥)或其它治療措施可通過調節(jié)一種或幾種通路，最終激活CREB，調節(jié) BDNF 等基因表達，影響神經元增殖、分化、成熟等可塑性改變，發(fā)揮抗抑郁作用。參與調節(jié)CREB的各調節(jié)因子之間、通路之間存在復雜的交叉聯(lián)系和相互作用，共同維持著CREB活性的平衡。近年來研究提示：抑郁模型小鼠，存在神經元蛋白和營養(yǎng)因子在海馬的表達異常，而這些變化可以被一些中藥逆轉[44]。當前致力于闡明信號通路、CREB、營養(yǎng)因子、神經再生之間是如何相互聯(lián)系的，以及細胞靶點、分子應答、行為反應的調節(jié)與抗抑郁之間錯綜復雜的關系。這將有助于我們以CREB為中心了解抑郁癥的病理生理機制，并在此基礎上研發(fā)出療效可靠、起效迅速、副作用小、經濟實用的新藥，尤其是幫助我們更好地認識一些中藥抗抑郁的可能機制，更充分地利用祖國寶貴的中醫(yī)藥資源。
細胞內信號轉導通路是目前抗抑郁機制研究的重點和熱點?？杀欢喾N不同的信號路徑激活。環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、鈣調蛋白激酶(CaMK)等3條通路是目前認為與抗抑郁相關、最主要的信號通路，這3個主要上游通路最終都使CREB磷酸化，進而調節(jié)其下游通路的基因表達，完成神經元生化功能，而CREB是上述3種通路的交匯點。
前期的研究證實：百合知母湯抗抑郁的機制與提高慢性不可預見性應激結合孤養(yǎng)抑郁(CUMS)模型大鼠海馬組織5-HT含量、提高腦組織中CREB(cAMP反應元件結合蛋白)mRNA的表達有關(見7.3)。有鑒于此，我們提出假設：百合知母湯抗抑郁的信號機制可能與以上三種細胞內通路有關，三個通路在抗抑郁機制中可能會有所偏重。
圍繞假設，基于CREB磷酸化通路，本課題擬將百合知母湯作用于CUMS大鼠，運用ELISA、RT-PCR、免疫組化、Western 印記等方法，檢測大腦組織cAMP信號中cAMP和PKA、MAPK信號中TrKB和BDNF、CaMK信號中鈣調蛋白(CaM)和CaMK等關鍵因子，初步探討百合知母湯抗抑郁的信號機制,篩選出該方抗抑郁的基因靶點。
2.立題依據(jù)
中藥復方具有成分多、作用環(huán)節(jié)多、靶點多的特點，多環(huán)節(jié)之間具有協(xié)同效應。因此研究中藥及其方劑的抗抑郁作用具有極大的挖掘潛力，而且對解決日益增加的抑郁患者的痛苦有重大的社會意義[45-46]。
四 研究內容及目標
1.建立慢性不可預見性應激結合孤養(yǎng)大鼠抑郁(CUMS)模型;
2.通過檢測用藥前后模型動物大鼠海馬組織環(huán)磷酸腺苷(cAMP)和蛋白激酶A(PKA)含量變化，評價百合知母湯對抑郁癥cAMP信號的干預作用;
3.通過檢測用藥前后模型動物大鼠絡氨酸激酶受體B(TrKB)和腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)含量變化，評價百合知母湯對抑郁癥MAPK信號的干預作用;
4.通過檢測用藥前后模型動物大鼠海馬組織中鈣調蛋白(CaM)和鈣調蛋白激酶(CaMK)含量變化，評價百合知母湯對抑郁癥CaMK信號的干預作用;
五 擬解決的關鍵問題
通過檢測cAMP、MAPK、CaMK三條信號轉導路徑上重要調節(jié)因子cAMP、PKA、TrKB、BDNF、CaM、CaMK用藥前后的變化，初步評估百合知母湯對以上三個信號轉導路徑的干預作用，評價方劑抗抑郁的機制，以便進一步篩選出方劑抗抑郁靶點。
六 實驗研究方案
1.實驗動物 SD雄性大鼠，7—12周齡，體重180—200g 2.藥物制備
按照《金匱要略》中記載的方法：百合七枚(劈)(約20g)，知母三兩(切)(約10g)即百合：知母=2:1。取百合100g，知母50g，先以清水將百合浸泡12小時，當白沫出，去其水，再加清水20__ml，武火煎開后改為文火，得百合煎煮液1000ml;再用清水20__ml，先武火后文火，得知母煎煮液1000ml;將2次煎煮液混合，文火濃縮得煎煮液1500ml。按照比例配制足夠數(shù)量百合知母湯煎煮液，放入冰箱-20℃儲存?zhèn)溆?。臨用時取出，濃縮至合適體積。為確保實驗結果的可比性，所有實驗都用同一批藥材。所有藥物的給藥劑量根據(jù)“人和動物體表面積折算的等效劑量比率表”計算而來：大鼠(200g)用藥量=人(70kg)日用劑量x0.018。每只大鼠的給藥體積為1ml/100g。
百合知母湯終濃度為2.2g/Kg/d(成人日用量30g)
氟西汀終濃度為1.8mg/kg/d(成人日用量20mg)
各組按濃度給藥28天，對照組給等體積的三蒸水。
3.CUMS抑郁癥模型大鼠制備
除正常對照組外，其余動物采用慢性輕度不可預見性溫和刺激結合孤養(yǎng)(CUMS)的造模方法：各造模組大鼠均單籠飼養(yǎng)，刺激因子包括禁食、禁水、4℃冰水游泳、夾尾、晃尾、潮濕墊料和傾斜45°、束縛應激、陌生物品、空籠刺激、噪音刺激、閃光刺激、水平震蕩、晝夜顛倒等。每日隨機給予2到3種刺激，使大鼠不能預料刺激的發(fā)生以避免產生適應。每種刺激交叉累計使用2-3次，持續(xù)21天，造模成功后，給藥期間繼續(xù)維持造模。建立慢性溫和不可預見性應激結合孤養(yǎng)(CUMS)抑郁癥大鼠模型,具體操作方法如下：
(1)禁水：即24小時不予供水。具體方法為,造模當天,上午8:00始,撤出大鼠籠內供水瓶,禁水24小時后,于次日上午8:00正常供水。
(2)禁食：即24小時禁止進食。具體方法為,造模當天上午8:00始,清除鼠籠內所有鼠糧,剝奪進食24小時后,禁食期間供水正常。禁食后給少量碎食,然后正常詞養(yǎng).
(3)晝夜顛倒：造模當天,上午8:00,將正常對照組大鼠轉移至其它SPF級實驗室后,關閉本實驗室所有電源,模仿黑夜,至20:00準時打開實驗室電源,模仿白晝,給大鼠制造晝夜顛倒的假象。
(4)夾尾：用纏裹有膠布的塑料夾,夾持鼠尾根部,時長為5min。
(5)晃尾：提住大鼠尾巴中部以每秒鐘1次的頻率,晃尾15分鐘,晃尾時力度要輕柔,避免牽拉大鼠尾尖部位,以防脫皮
(6)冰水游泳：取一直徑為30cm玻璃缸,注入適量清水后加入適量冰塊,調整水溫至4℃(根據(jù)天氣情況,適當調整,以防凍傷),同時調整水液平面據(jù)器皿邊緣約15-20cm,然后將大鼠放入冰水中,強迫其游泳5min。5min后將大鼠榜出,先用干毛巾擦拭動物毛發(fā),然后用吹風機吹干,避免感冒。每次冰水游泳結束后需撈干凈游泳器皿內大鼠類便,避免對下一只鼠產生影響。
(7)高速水平震蕩：將動物放入空的鼠籠中，進行人工振蕩，2 次/秒，有效節(jié)奏連續(xù)持續(xù) 5min;或者水平晃動，1次/秒，持續(xù)30分鐘
(8)噪音刺激：90分貝噪音刺激2h，盡量選在白天大鼠休息的時候給予此種刺激。
(9)束縛刺激：將大鼠束縛于500ml燒杯中2h，注意保持通氣。
(10)潮濕環(huán)境：將大鼠的墊料換以潮濕墊料，持續(xù)刺激12h。
(11)異物刺激：往大鼠籠內放置金屬條棒，鈍性玻璃器皿的異物予以刺激，持續(xù)2h。
(12)空 籠：撤掉大鼠籠里面的墊料籠子里不放置任何物品，持續(xù)12h。
(13)傾斜刺激,：該刺激因素通常在禁水后進行,應激動物本身饑渴,在傾斜的鼠籠中覓食覓水更為困難。
(14)閃光刺激：LED頻閃燈，頻閃頻率2次/s，持續(xù)刺激2h。
以上各種刺激的實施順序遵循由弱(輕刺激,如晝夜顛倒、禁水禁食、潮濕環(huán)境)到強(重刺激,如冰水游泳,夾尾，晃尾，束縛刺激，噪音，閃光等刺激)的原則,以避免刺激之間的交互作用。每日采用1種刺激,平均每種刺激被采用2—3次,同種刺激不能連續(xù)出現(xiàn),使動物不能預料刺激的發(fā)生。
4.行為學指標的測量
主要包括 1%蔗糖水消耗率、體重變化率、敞箱實驗、Morris 水迷宮實驗
4.1體重變化率
分別在實驗的第 1d、15d、22d、29、36d 、43d、50d、57、64d進行。動物體重變化率(%)=(當日測量的體重-第1天的體重)/第1天的體重。 4.2糖水消耗實驗
實驗前期準備，在安靜的環(huán)境內訓練動物適應含糖飲水：第一個24h，每籠同時放置兩個完全相同的動物水瓶，兩瓶均為同等重量的1%蔗糖水;第二個24 h， 一瓶為1%鹿糖水,一瓶為相同重量的純凈水。然后進入實驗階段，禁水禁食24h后,測定9p.m-7a.m 10小時內大鼠1%蔗糖水攝入量。糖水偏愛率% =糖水消耗量/(糖水消耗量+清水消耗量)X100%。適養(yǎng)期間進行三次糖水偏愛篩選,將糖水偏愛率異常的大鼠剔除,不用于正式實驗(三次糖水偏愛測試中均只喝自來水的大鼠為異常大鼠)。測定動物在實驗第1天、第22天、第49天、第64天糖水偏愛率的變化。
4.3 敞箱實驗
敞箱實驗(Open-field Test )是評價實驗動物在新異環(huán)境中自主行為、探究行為與緊張度的一種方法。以實驗動物在陌生環(huán)境中某些行為的發(fā)生頻率和持續(xù)時間來反應實驗動物的自主行為與探究行為,以尿便次數(shù)反應其緊張度。敞箱實驗(Open-field Test):木質敞箱,立方形,長、寬、高為80cm x 80cm x 40cm,內側壁、底面為黑色,底面用白線劃分為面積相等的25塊正方形。室內安靜環(huán)境下將大鼠放置于敞箱底面的中心方格內,人距離敞箱1米之外,記錄大鼠在3 min內活動頻率。以穿越底面正方形塊數(shù)為水平穿越格數(shù)(4爪均進入方格才記數(shù),為水平運動得分)、以兩后肢直立的次數(shù)為豎立活動次數(shù)(兩前爪騰空或攀附墻壁,為垂直運動得分),理毛次數(shù)以及大小便次數(shù)。每只動物只測1次,測定完畢后徹底清潔敞箱再進行下一只觀察。分別于實驗前1天、實驗第22天和最后1天進行。
4.4 Morris 水迷宮實驗
該實驗是對大鼠學習記憶能力的檢測，主要包括定位航行實驗和空間搜索實驗。實驗用主要裝置包括一個銀灰色圓形水池(直徑 150cm)，一個白色平臺(直徑10cm)，一臺跟蹤攝像機以及與攝像機相連的計算機，池內盛水，且水溫保持在 22-24℃。最后一次敞箱實驗結束后第二天開始，首先訓練大鼠尋找平臺，平臺置于水面下 2cm，攝像機位于水池上方約 200cm，能清晰攝取到大鼠的運動軌跡。將水池分為四個象限，將大鼠從任意一個象限放入水中，記錄其找到平臺的路徑及時間，前幾次訓練中，若時間超過 120s，則引導動物到平臺，并在平臺上停留10s。然后進行定位航行與空間搜索實驗。定位航行實驗：訓練結束后的第一天，保持平臺位置不動，將大鼠隨機從一個象限放入水中，開始記錄大鼠的運動軌跡及找到平臺的時間;空間搜索實驗：定位航行實驗結束后，將平臺撤走，將動物從原平臺位置的對側放入，開始記錄 120s 內大鼠的運動軌跡及潛伏期與穿越平臺次數(shù)。以此做為對空間記憶能力的檢測指標。
4.4 懸尾實驗
將實驗動物通過固定動物尾端2cm處使其頭向下懸掛，動物在該環(huán)境中拼命掙扎試圖逃跑又無法逃脫，從而提供了一個無可回避的壓迫環(huán)境，一段時間的實驗后，記錄處于該環(huán)境的動物產生絕望的不動狀態(tài)的時間。動物表現(xiàn)出的這種典型的“不動狀態(tài)”，反映了一種被稱之為“行為絕望狀態(tài)”，這種行為絕望模型與抑郁癥類似，而且對絕大多數(shù)抗抑郁藥物敏感，而且其藥效與臨床藥效顯著相關。
5.尼氏染色
正常的神經細胞都含有一定數(shù)量的尼氏小體，它們主要分布于神經細胞的漿中，形狀有大有小，如三角形，有的為橢圓形。這些物質能被大部分的藍色染料所染色，這些染料如焦油堅牢紫(Cresyl fast violet)、亞甲藍(methylene blue)、甲苯胺藍(toluidine blue)、硫董(thionin)等將其染為藍色。但是，當神經細胞受傷后，胞質內的尼氏體更可發(fā)生變化，嚴重的可消失，通過觀察尼氏小體的數(shù)量可以探知神經元的受損或修復情況。
各組大鼠分別于末次給藥后麻醉,使大鼠仰臥位固定于實驗臺上,打開腹腔,掀起右肺,在靠近脊柱處找出下腔靜脈和腹主動脈。用止血鉗夾住腹主動脈和下腔靜脈,接著打開胸腔,用針頭經左心室插入升主動脈,后剪開右心耳,進行灌注。先用0.9%的生理鹽水250ml經心臟快速灌注沖洗,再用4%的低聚甲醛,O.lmol/L的磷酸緩沖液(PH7.2-7.4)350ml灌注。在灌注固定液過程中后期大鼠頸部、肩部和雙前肢逐漸變硬。灌注后取大鼠全腦,10%低聚甲醛固定48-60h。以松果體為標志物,向頭側橫向切取3段,每段厚2mm。石蠟包埋,連續(xù)切片,片厚lOpin,切片,用于尼氏染色及后期的免疫組化。
將腦片置于0.5%甲苯胺藍(母液：甲苯胺藍1g，無水乙醇100ml。使用時按1:1比例與新鮮的0.1%NaCl溶液混合成工作液)或焦油紫(焦油紫0.1g;蒸餾水99ml;1%冰醋酸1ml)中室溫下染色30min。在75%、95%、100%酒精中各脫色1min，二甲苯透明10min，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察照相并對尼氏染色陽性神經元進行計數(shù)。
6.測量生化指標
主要包括CREB、BDNF mRNA在大鼠海馬內的表達;免疫組化檢測TrKB、ERK1/2蛋白的表達;免疫印跡法檢查CaM、CaMKⅡ的表達。
6.1逆轉錄-聚合酶鏈式反應法檢測CREB、BDNFmRNA在大鼠海馬內的表達 首先勻漿：海馬新鮮組織約100mg,加入1ml的TRIZOL試劑,用電動勾漿器進行勾漿;兩相分離:分裝后樣品于15到30℃孵育5分鐘。每1ml的TRIZOL試劑勾漿的樣品中加入0.2 ml的氯仿,蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體15秒后,15-30℃孵育2到3分鐘。4℃下120__ g離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色紛氯仿相,中間層核上層的無色的水相。RNA全部被分配于水相中,水相的體積大約是勾漿時加入的TRIZO試劑的60%;RNA沉淀:將水相轉移到新離心管中。水相與異丙醇混合以沉淀其中的RNA,加入異丙醇的量為每個樣品勻漿時加入，1mlTRIZOL試劑加0.5 ml的異丙醇，混勾后15-30℃孵育10分鐘后,于4℃ 12,000g離心10分鐘;RNA清洗:移去上清液,每1mlTRIZOL試劑勻漿的樣品中加入至少1ml的75%乙醇,清洗RNA沉淀。振蕩后,4℃，7500g離心5分鐘;重新溶解RNA況淀:去除乙醇溶液,空氣中干燥RNA沉淀5-10分鐘,切勿真空離心干燥，注意RNA沉淀不要完全干燥,否則將大大降低RNA的可溶性，部分溶解的RNA樣品A260/280比值將小于1.6;溶解RNA時,先加入無RNA酶的水用槍反復吹打幾次,然后55-60℃孵育10分鐘。莰得的RNA溶液保存于-70℃;濃度測定:取少量液體用TE稀釋(一般1: 100稀釋)后,讀取其在紫外分光光度計260nm和280nm處的吸收值,A260下讀值為1表示40ugRNA/ml;樣品RNA濃度(ug/ml)=A260×稀釋倍數(shù)40ug/ml;RNA純度檢測:RNA溶液的A260/A280的比值范圍應在1.8-2.1之間;
在無核酸酶的離心管中配制反應液： RNA，1-5μg;逆轉錄引物 (20um)，1μl;RNase free H2O，使總體系為12.5μl(反應液配制在冰上進行)。輕輕混勻,65℃變性10min，立即置于冰上2min后加入：RNA-primer mix，12.5μl;5×RTReaction Buffer ，4μl;dNTP(10mM)，2μl;RiboLock RNase Inhibitor ，0.5μl;RevertAid Reverse Transcriptase，1μl?？傮w系20μl，25℃孵育10min后42℃孵育60min，70℃ 加熱滅活10 min，-20℃保存。 設計相應的引物，配制成合適濃度工作液，Real time-PCR儀反應體系液配制：2X all-in-OneTM qPCR Mix(含ROX)，10μl;引物(10pmol/μl)，上下游各0.4μl;ddH2O，4.2μl;cDNA(適度稀釋) ，5μl?？傮w系20μl。反應條件：95℃，10min,以下反復40個循環(huán);95℃,10s;60℃，20s;72℃，20s。最后結果采用2-ΔΔCT法進行測量。
6.2免疫組化法檢測TrKB、ERK1/2的表達
切片后,常規(guī)脫蠟至水;3%過氧化氫孵育lOmin,可以滅活內源性酶的活性,蒸水沖洗,5minx3次;微波熱修復3min,PBS沖洗,5minx3次;滴加5%BSA封閉液,室溫孵育30min;滴加一抗,5-HTiaR 一抗稀釋為1:50,PKA稀釋為1:100,CREB稀釋為1:100,4°C過夜,PBS沖洗,5minx3次;滴加二抗生物素標記的羊抗兔IgG,37°C孵育30min,PBS沖洗,5minx3次;滴加三抗試劑SABC,37°C孵育30min,PBS沖洗,5minx3次;DAB顯色劑顯色,室溫下15inin,蒸饋水沖洗,脫水,透明,封片最后DAB 顯色劑顯色，室溫下20min，蒸餾水終止反應，常規(guī)脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察。每只動物取相同部位的3張切片，每張切片選取3個視野，在同一放大倍數(shù)、同一光強度下，采用CMLAS 彩色病理圖像分析系統(tǒng)，分別計算每張切片中海馬組織TrKB、ERK1/2表達的平均光密度。
6.3免疫印跡法測定鈣調素(CaM)、鈣調蛋白激酶(CaMKⅡ)蛋白表達變化
取新鮮海馬約100mg置1.5mlEP管中，生理鹽水沖洗兩遍，充分剪碎，離心去上清。每管加4℃裂解液1ml，繼續(xù)剪碎、混勻，低溫超聲勻漿;14000轉離心，5min，取上清備用。取上清5μl，加考馬斯亮藍3μl，去離子水95μl，595nm 處，1cm光徑，蒸餾水調零，測各管OD值;根據(jù)樣品OD值調整蛋白濃度。樣品煮沸5min，冷卻后取50μg上樣;電件(12%濃縮膠：90v30min;10%分離膠：120v120min);NC膜轉印(70v120min);5%脫脂奶粉TBST溶液封閉抗體，搖床2h，TBS漂洗5min，3次。一抗孵育(兔抗人CaM、CaMKⅡ多克隆抗體1:500稀釋)，4℃過夜;二抗孵育(辣根酶標記羊抗兔IgG 1:1500稀釋)，37℃ 1h;掃描并分析結果，條件設置為曝光2min，CCD自動獲取圖像，同時以1:1000稀釋的小鼠抗大鼠beta-actin單克隆抗體作為內參照，各蛋白相對表達量以相應蛋白/beta-actin灰度值表示。
七 課題創(chuàng)新性
1. 本課題首次系統(tǒng)地由宏觀到微觀地進行綜合研究，能從行為學水平→細胞形態(tài)水平→分子水平三個層次經行分析，以期待比較完善地探索百合知母湯抗抑郁功效及其機理。
2. 本課題選用了先進的指標，并且采用蛋白水平和mRNA水平檢測方法，檢測神經營養(yǎng)因子及相關細胞內信號轉導通路中關鍵因子的變化，以期探尋本方提高抑郁癥大鼠腦組織CREBmRNA的表達水平的進一步信號轉導機制。
八 預期結果
1. 成功完成大鼠抑郁癥CUMS模型的建立，構建良好的實驗平臺。
2. 探討百合知母湯抗抑郁機制中三種信號轉導系統(tǒng)發(fā)揮的作用，篩選百合知母湯抗抑郁的靶點通路。
3. 預計在國內學術期刊上發(fā)表論文2篇。
參考文獻
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選題背景和意義
選題背景
幾十年來，在計劃經濟體制下，我國醫(yī)療服務屬福利化范疇;醫(yī)療服務市場化是在宏觀的市場化改革推動下進行的。隨著醫(yī)療體制改革的不斷深入，醫(yī)療服務具有市場的性質已是不爭的事實 。加入WTO以后，醫(yī)療市場逐漸開放，民營醫(yī)院的迅速崛起，中外合資合作醫(yī)院的建立，醫(yī)療市場競爭日趨激烈。
作為省會城市，鄭州除了省市各級醫(yī)療機構之外，還有很多不同種類的專科醫(yī)院和專家門診，近年來，鄭州市醫(yī)療衛(wèi)生行業(yè)更是進入快速發(fā)展階段，目前醫(yī)院總數(shù)已經達到300余家。
作者在大三學習期間，承擔了河南省中醫(yī)院服務營銷管理的研究，本文從服務質量差距模型的角度，對醫(yī)院服務營銷存在的問題及應對策略進行分析。
選題意義
現(xiàn)實意義
通過對河南省中醫(yī)院200名患者服務滿意度調查，圍繞就醫(yī)環(huán)境、技術水平、服務態(tài)度、服務效率、服務收費、醫(yī)德醫(yī)風等6方面的分析，客觀公正地收集患者及家屬對醫(yī)院各方面的意見和建議，從而為科室考核、醫(yī)院的管理和發(fā)展提供可行的依據(jù)。
理論意義
河南省中醫(yī)院作為一家集醫(yī)療、教學、科研為一體的現(xiàn)代化綜合性三級甲等中醫(yī)院，目前在鄭州市醫(yī)療行業(yè)屬上游位置，通過對其服務質量差距模型的分析，探究服務質量差距產生的原因，并尋求應對的措施，使每一位醫(yī)務工作者都樹立強烈的市場意識、服務意識、競爭意識和營銷意識，在全院建立起 醫(yī)療服務營銷 模式，不但對自已是一個提高，同時也對河南省其他醫(yī)院的發(fā)展作出應有的貢獻。
國內外相關研究綜述
目前國際上比較流行的是以下三種模型，當然在服務營銷領域，這三種理論模型并非全部，其它學者還提出了很多其它的理論模型，但這三種是最具影響和代表意義的，因為這三種模型無一例外地將研究的重點放在面對面的服務體驗上。
服務體驗及其構成要素
任何服務體驗都由四個要素構成：1)服務員工;2)服務設施;3)服務顧客;4)服務過程。盡管各種服務體驗都包括這四種要素，但四要素對服務體驗的貢獻程度卻因服務而異。譬如，在一些服務體驗中，員工就扮演著不太重要的角色，例如相對于牙醫(yī)來說，電影院工作人員對觀眾欣賞影片的'影響就很小。
員工既包括那些與顧客直接接觸的人(如服務生、出納等)，也包括那些雖在顧客的視線之外，但同樣為服務的提供做出貢獻的組織成員(如廚師、銀行會計等)。服務設施既包括顧客所能接觸到的設施，(如餐廳、銀行大廳等)，也包括那些顧客一般很少接近的設施(如飯店的廚房、銀行的保險柜等)。顧客是指服務的接受人(如用餐人、存款人等)與那些與其共享服務設施的人。最后，服務過程是指為提供服務而從事的一系列活動(即在用餐或存款時，顧客與服務組織所采取的各種行動)的活動順序。
服務體驗的四個構成要素，皆在服務體驗的形成過程中扮演著重要的角色。然而，對不同的服務互動過程而言，并非所有的服務體驗構成要素皆對服務體驗施加同等重要的影響。為兼容這些特殊情況，任何服務體驗分析框架都應允許各構成要素的重要性有所不同。
服務營銷組合理論
營銷組合，是指組織在識別可控制營銷因素的基礎上，根據(jù)顧客的需求來確立營銷因素的最佳組合。早期的營銷理論，幾乎皆由營銷組合概念來驅動。在有關營銷組合的諸多觀點中，最具影響力的當屬 4P's 營銷組合，其中的 4P 分別為產品(product)、價格(price)、促銷(promotion)與地點(place)。Booms與Bitner(1981)建議，對服務組織來說，應在 4P 的基礎上增加另外三種營銷因素，即參與者(participants)、有形證據(jù)(physical evidence)和服務裝配過程(process of service assembly)，故服務營銷組合就是在傳統(tǒng)的 4P's 營銷組合的基礎上增加上述3 P's。服務營銷組合中所新增加的 3P ，抓住了服務營銷的本質，指明了服務產品與有形產品的差別，也為我們提供了 一種剖析服務體驗及其構成要素的理論模型。
參與者是指卷入服務產出過程的所有人，不僅包括顧客，而且包括員工。有形證據(jù)是指服務環(huán)境以及服務的其他有形層面。服務裝配過程是指為提供服務而發(fā)生的一系列活動及其發(fā)生順序。對任何服務而言，新增加的每一種營銷因素都會影響顧客對服務的總體感覺。因此，意欲針對具體細分市場拓展服務業(yè)務的組織，可根據(jù)目標顧客的特點來調整其中的一種或多種營銷因素，以突出服務特色。服務特色可來自于有形證據(jù)。同樣，一個服務組織也可借助服務參與者的調整來差別化它的服務。與傳統(tǒng)的 4P 一樣，新加入的 3p 之間也存在多重聯(lián)系。強化其中的一個營銷因素以影響顧客的消費感覺，則可能需要或引發(fā)其它營銷因素的變化。
總之，服務營銷組合模型識別融入3個新的營銷因素，而此 3P 對營銷一種服務時非常重要。服務營銷組合模型的優(yōu)勢之一，是其建立在營銷組合這一較為成熟的營銷概念之上，既突出了這一理論模型的正統(tǒng)性，又強調了服務營銷與有形產品營銷的差別之處。
服務劇場模型
把服務比作一場戲劇，服務劇場模型(Grove and Fisk，1983，1992)擁有與舞臺產品一樣的構成要素：演員、觀眾、設施、前臺、后臺與表演。
研究內容、重點和難點
研究的基本思路和框架
本文以河南省中醫(yī)院服務滿意度調查問卷分析出的問題為出發(fā)點，運用服務質量差距模型，分析導致提供服務失敗最可能出現(xiàn)的5種差距，幫助醫(yī)院管理者發(fā)現(xiàn)服務質量問題的根源，努力消除那些存在的差距，提高醫(yī)院醫(yī)療服務質量。
論文題目：
探討治療四肢長骨骨折不愈合的手術改進方法。
一、選題依據(jù)、目的和意義
骨折不愈合是骨科臨床常見病癥，其中以四肢長骨多發(fā)，例如脛骨，股骨，肱骨等，針對四肢長骨骨折不愈合二次手術我院多才用植骨術配合LCP重新內固定。自體髂骨作為植骨材料具有較多的優(yōu)點：如取材簡單、組織相容性好、無移植排斥反應、骨誘導作用強等，這些優(yōu)點使得髂骨成為一種最佳的植骨供材，這在臨床上已形成共識。植骨是治療骨折不愈合的重要方法，其機制是爬行替代所引起的支架作用與供給礦物質的作用，爬行替代順利進行的條件要求準確的復位、充分的植骨和堅強的固定。為達到充分的植骨，及早促進骨折愈合，我們采用髓內外36°植骨的方法，外用鋼絲環(huán)扎，配合LCP堅強內固定，術后3~1個月內進行隨訪，根據(jù)愈合情況和功能恢復情況分析手術的臨床療效。選題目地在于探討治療四肢長骨骨折不愈合的手術改進方法和療效，為臨床治療提供參考。
本課題以導師多年的臨床資料為依據(jù)，通過對骨折不愈合手術治療的國內外文獻進行系統(tǒng)整理，結合山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院骨科病房對四肢長骨骨折不愈合患者的隨訪調查及回顧性分析，根據(jù)骨科特殊生物力學特點和導師治療骨折不愈合的多年臨床體會，分析治療效果，并對手術中的細節(jié)問題做初步探討與論述。同時也希望可以通過對導師的臨床實踐的研究、總結，能為今后的臨床工作提供一些幫助和指導。
二、本課題目前國內外研究的動態(tài)、水平
治療骨折不愈合，可分為手術治療和非手術治療，其中手術治療最重要的就是植骨術加更改斷端內固定。骨折不愈合應用自體骨移植治療效果顯著，已經形成共識。植骨是治療骨不連的重要方法，植骨方式臨床多采用髓內外聯(lián)合植骨。沿肌間隙進入，骨膜下小心剝離顯露骨折部位，取出內固定器械，清除骨斷端間瘢痕，咬除硬化骨，打通髓腔，修整骨折端，手法復位，按照骨缺損情況取骨。髓內植骨以比髓腔稍粗的骨棒，貼緊髓腔骨質。髓外上蓋植骨宜用螺絲釘固定植骨塊。骨碎屑充分填充殘余的空隙，這樣才能確實達到植骨的目的和要求。自體皮—松質骨植骨的爬行替代縮短了骨折愈合過程，新鮮的自體骨具有生物活性，不存在免疫排異，無傳染疾病的風險，同時存在骨傳導和骨誘導能力。
內固定物更換得堅持以下原則，原鋼板內固定者，可更換成交鎖髓內針或更長的鋼板置于張力側。原交鎖髓內針內固定者，可選用更大號髓內針或鋼板內固定。原先短鋼板內固定者，可改成較長的鋼板。所有病例均需植骨。更換內固定物后，術后石膏外固定者，應及早進行肌肉收縮鍛煉活動，骨痂生長良好后，去石膏開始關節(jié)屈伸功能鍛煉。但是臨床上醫(yī)師應該具體問題具體對待，可以根據(jù)骨痂生長情況酌情處理，出院時務必詳細醫(yī)囑病人注意事項，配合醫(yī)生，直到骨折完全愈合。LCP鋼板內固定適用于四肢長骨骨折不愈合，可用拉力螺釘固定碎骨塊及移植骨塊，并對斷端行軸向加壓鎖定。手術關鍵是將骨折端的瘢痕結締組織全部切除，骨端硬化骨全部咬除，露出正常骨質，鉆通髓腔，植入的骨塊必須牢固的嵌入缺損區(qū)，間隙用松質骨填滿，。應積極正確指導術后功能鍛煉，嚴格定期隨訪及指導。避免過早的不正確的負重。綜上所述，對于骨折不愈合的治療，自體骨移植療效確切，安全穩(wěn)妥，技術成熟，應用廣泛，值得提倡。
三、課題研究的主要內容
（一）臨床資料
病例來源：本研究病例均采集于山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院骨科病房。
（二）采集時間
9年5月~1年1月。
（三）病例選擇
1、診斷標準
（1）病史：明確的外傷史，骨折后6個月沒有愈合，并且沒有進一步愈合傾向已有3個月。
（2）癥狀：患者骨折端成角、旋轉、側移位、短縮畸形或者節(jié)段性骨缺損、持重疼痛或不能持重、局部在應力下疼痛等。
（3）體征：局部竇道形成、流膿、假關節(jié)形成或伴有局部軟組織瘢痕、缺損等。
（4）輔助檢查：X線表現(xiàn)：骨端硬化，髓腔封閉。骨端萎縮疏松，中間存在較大的間隙。或骨端硬化，相互成為杵臼假關節(jié)等這三種形式中的任何一種就可以定為骨折不愈合。
2、納入病例標準：
（1）符合本病診斷標準。
（2）骨折平均愈合時間超過半年以上，有假關節(jié)形成。
（3）骨折平均愈合時間超過半年以上，多次復查X線拍片顯示，骨折線清晰可見，未見內外骨痂或內外骨痂極少。
（4）拍片顯示骨折線增寬，骨折端骨面致密性硬化，骨髓腔封閉，骨質疏松，骨痂間無骨小梁形成，或伴有明顯的骨缺損。
（5）臨床表現(xiàn)有骨的感染、缺損、畸形、肢體不等長、局部竇道形成、流膿等。
3、排除病例標準：
（1）不符合上述診斷標準者。
（2）患者有嚴重的內科疾病，不能夠耐受手術者。
（3）精神疾病患者。
（4）資料不全影響判斷者。
4、療效觀察方法
對骨不連愈合的評價應包括骨愈合和功能恢復雙重評價：
（1）骨愈合評價標準：本評價結果決定于四項指標：骨愈合、感染、畸形和肢體長度，其中骨愈合標準為X線示骨折線模糊，有連續(xù)骨癡通過骨折線，拆除或試行松動外固定物后骨折無異?；顒?，下肢可無痛行走，上肢持物骨折處有穩(wěn)定感。 評價標準：
優(yōu)：骨折愈合，無感染，斷端畸形<°，雙側肢體不等長< CM。
良：骨折愈合及其他三標準中兩項。
可：骨折愈合及其他三標準中一項。
差：骨折未愈合或再骨折或雖愈合但不具備其他三標準中任何一個。
（2）功能評價標準：
功能的評價分上肢與下肢的不同，上肢主要考慮其靈活性，而下肢主要功能為負重行走。
將下肢評價指標定為以下五項：
①明顯跛行。
②踝或膝任何一關節(jié)僵硬（完全伸膝或踝完全背伸時，活動范圍較正常或對側喪失15°以上）。
③軟組織情況不良。
④有限制活動或影響睡眠的疼痛存在。
⑤喪失工作能力或生活不能自理。
優(yōu)：存在工作能力且無其他四項指標。
良：存在工作能力且具以上四指標中一至二項。
可：存在工作能力并具以上指標中三至四項。
差：喪失工作能力或生活不能自理，不考慮是否具備其他指標。
對上肢功能評價參照"Seu和Hdlly對上肢功能評價標準"[3]。
觀察指標為三項：疼痛、關節(jié)活動范圍、日常活動能力。
（3）上肢功能評價標準。
5、課題進度及安排：
9—5——1—1收集病例及隨訪。
1—1——1—1資料匯總及數(shù)據(jù)分析。
11—1——11—3撰寫論文、定稿。
四、本課題特色、預期取得的結果
骨折不愈合應用自體骨移植治療效果顯著已經形成共識，治療過程中的經驗總結需要不斷的進行，更要求開展回顧性工作及進行系統(tǒng)的整理。因此，骨折不愈合的臨床資料分析就顯得尤為重要。
本課題通過搜集整理山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院骨科9至1年期間的患者臨床資料，對于自體骨移植治療骨折不愈合的相關性問題進行臨床研究與總結。應用統(tǒng)計分析評分進行術前、術后及相關方面比較，對自體骨移植治療骨折不愈合的臨床療效獲得客觀、真實、準確的評價，并進一步指導臨床工作。
五、可行性分析
山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院骨科是山東省中醫(yī)管理局評定的重點學科、重點科室，在省內知名度較高，病人來源廣泛。導師王明喜主任醫(yī)師從事臨床工作3余年，具有豐富的臨床經驗，對治療骨折不愈合做過大量研究、臨床工作，并取得了良好的效果。本課題搜集整理山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院骨科近幾年的臨床資料，并在導師指導下對這些一手資料進行研究與總結。
四肢長骨骨折不愈合由于并發(fā)癥較多，治愈比較困難，手術后功能恢復過程漫長，因此在治療過程中，經驗的總結是非常必需的，也是可行的。本課題主要研究山東省中醫(yī)院近年應用鋼絲環(huán)扎36°植骨配合LCP內固定治療四肢長骨骨折不愈合的治療效果分析情況，因此在選題上可行性較強。課題的研究也得到了學校、附院等各部門、科室的大力支持。相信可以圓滿地完成課題。
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